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        非接觸式超聲在甲基化測(cè)序方面的應(yīng)用

        發(fā)布時(shí)間:2024-10-01 來(lái)源:新芝生物 瀏覽量:0
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        實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

          為了獲取能與巖沙海葵毒素(Palytoxin,PLTX)特異性結(jié)合的天然適配體,目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)提取得到的基因組通過超聲打斷的方式變成 100-300 bp 的 DNA 片段,再通過冷淬的方式獲得折疊后的 ssDNA。將 ssDNA 進(jìn)行甲基化修飾后進(jìn)行測(cè)序,同時(shí)對(duì)甲基化修飾后的片段進(jìn)行親和力測(cè)定,最終獲得特異性強(qiáng)、親和力高的天然適配體。

        實(shí)驗(yàn)步驟

          HaCaT 和 CHO-K1 細(xì)胞基因組 DNA 的提取:

          ①常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞,待其融合度達(dá)到 70% - 80%左右時(shí),吸除原培養(yǎng)基,向每 10 cm2的貼壁細(xì)胞中加入 1 mL PBS,用移液槍吹落細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP 管中,5000 rpm 離心 5 min,棄上清,加入 200 μL 的 PBS 重懸細(xì)胞;

         ?、诎凑?TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit 說(shuō)明,加入 180 μL Buffer GB、20 μL Proteinase K 和 10 μL RNase A,充分吹打混勻,于 56℃水浴 10 min;

         ?、巯蛄呀庖褐屑尤?200 μL 100%乙醇,充分吹打混勻后,將其轉(zhuǎn)移至已經(jīng)安置于 Collection Tube 上的 Spin Column 內(nèi),12000 rpm 離心 2 min,棄濾液;

         ?、軐?500 μL Buffer WA 加入至 Spin Column 中,12000 rpm 離心 1 min;

         ?、輰?700 μL Buffer WB 加入至 Spin Column 中,12000 rpm 離心 1 min,并重復(fù) 1 次;

          ⑥將 Spin Column 安置于 Collection Tube 上,12000 rpm 離心 2 min;

          ⑦將 Spin Column 安置于新的 1.5 mL EP 管上,在 Spin Column 膜的中央處加入 50-200 μL 已加熱至 65℃的 Elution Buffer,室溫靜置 5 min;

         ?、?2000 rpm 離心 2 min,洗脫 DNA;

          ⑨使用 NanoDropTM One 進(jìn)行基因組 DNA 定量。

          片段化基因組 :將提取的基因組 DNA 放置于SCIENTZ08-IIIC非接觸式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中,設(shè)置功率80%,超聲開時(shí)間為 1 s,超聲關(guān)時(shí)間為 3 s,工作總時(shí)間為 150 min,溫度為 15℃,片段化基因組 DNA。

          核酸凝膠電泳 :利用核酸凝膠電泳檢測(cè) DNA 片段的大小,核酸凝膠的配方為:ddH2O 6.69 mL、40%聚丙烯酰胺 1.31 mL、5×TBE 2.4 mL、10%過硫酸銨(Ammonium persulfate,AP)72μL、四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine,TEMED)18 μL。在樣品中加入 5×上樣緩沖液,充分混合均勻,將配置好的凝膠放于電泳槽中,加入 1×TBE 電泳緩沖液,垂直拔出梳子,立刻用緩沖液沖洗加樣孔,將樣品緩慢均勻加入孔中,300 V 電泳 20 min,取出凝膠放置于水平搖床,用 Gel-red 染色液避光孵育 20 min,在凝膠成像儀中成像,檢測(cè) DNA 片段大小范圍。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果

          基因組來(lái)源的 ssDNA 文庫(kù)的評(píng)價(jià)

          超聲破碎基因組后,利用核酸凝膠電泳檢測(cè)基因組片段大小。如圖所示,DNA 片段長(zhǎng)度富集于 200 - 300 bp 之間,當(dāng)其猝冷變性折疊成單鏈后,ssDNA 長(zhǎng)度則集中于 200-300 nt 之間,從 HaCaT 和 CHO-K1 細(xì)胞來(lái)源的基因組文庫(kù)中各取 18 nmol 的 ssDNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        結(jié)論

          結(jié)論:提取得到的細(xì)胞基因組經(jīng)過超聲打斷后得到 200-300 bp 大小的片段,可直接用于高通量測(cè)序,也可重硫酸鹽轉(zhuǎn)化后用于甲基化測(cè)序。

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