接觸式超聲在胞內蛋白及核酸提取過程中的應用

背景

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又稱內毒素，為革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的組成成分，可作用于膜受體激活多種細胞（巨噬細胞、上皮細胞、內皮細胞等）信號轉導系統(tǒng)，促進促炎細胞因子和其他炎性介質的合成及釋放，引發(fā)炎癥反應?？蛻舨捎肔PS誘導RAW264.7巨噬細胞建立體外炎癥模型，使用超聲波細胞粉碎機將蛋白及核酸從炎癥細胞中分離出來，從基因、蛋白相對表達水平方面評估羊棲菜多酚（Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs）的抗炎活性，為其在新型抑炎制劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.1?棲菜多酚的制備

取?燥?棲菜粉末，加?體積分數(shù)60%?醇溶液，使?SCIENTZ-IID超聲輔助浸提（料液?1∶20（m/V）、50 ℃、60 min），抽濾后真空減壓蒸餾去除?醇，獲?棲菜粗多酚溶液，依次采?等體積?油醚、?酸?酯分級萃取，真空減壓蒸餾后凍?（使?SCIENTZ-12N過夜凍?），獲得HFPs粉末。測得HFPs粉末總酚含量為23.67±0.24 mg/g。利??菌?配制成多酚?液，再以細胞培養(yǎng)液稀釋?不同濃度，?于后續(xù)實驗。

1.2 炎癥細胞培養(yǎng)

使?完全培養(yǎng)基（含10%（體積分數(shù)，下同）胎??清和1%?鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基）培養(yǎng)RAW264.7細胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，細胞融合度約80%時進?傳代。然后分成3組進?培養(yǎng)：①陰性對照組，僅加?含10%胎??清的DMEM培養(yǎng)基；②LPS陽性對照組，加?含LPS（1μg/mL）和10%胎??清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h；③HFPs+LPS組，經含不同質量濃度（10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL）HFPs和10%胎??清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24    h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎??清的DMEM培養(yǎng)基刺激24h。

1.3 RAW264.7細胞炎癥相關基因相對表達量的測定

1.2中培養(yǎng)的三組細胞培養(yǎng)結束后棄去培養(yǎng)液，?0.01 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細胞2 次，每孔加?500 μL TRIzol試劑，使?SCIENTZ-IID加速破碎細胞協(xié)助提取總RNA，超聲參數(shù)為：100 W，1 s 開1 s關，共1 min，并將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采?SYBR Green嵌合熒光法與引物進?實時熒光定量PCR。測定?的基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）和內參基因次?嘌呤磷酸核糖基轉移酶1（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1）Ct值，采?2－ΔΔCt法計算?的基因的相對表達量。

1.4 MAPKs、NF-κB信號通路關鍵蛋?相對表達量測定

1.2中培養(yǎng)的三組細胞培養(yǎng)結束后棄去培養(yǎng)液，?0.01 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細胞2 次，加?200 μL RIPA細胞裂解液，使?SCIENTZ-IID加速破碎細胞協(xié)助提取蛋?質，超聲參數(shù)為：100 W，1 s 開1 s關，共1 min，離?（12000 r/min、4 ℃）10 min取上清液。采?BCA蛋?質量濃度測定試劑盒測定各組蛋?濃度，?蛋?上樣緩沖液調整蛋?質量濃度為2 mg/mL，95 ℃加熱10 min使蛋?變性然后進???烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝?電泳分離；濕轉到聚偏?氟?烯膜；5%（質量分數(shù)）脫脂奶粉（TBST溶液配制）封閉1 h；?抗4 ℃孵育12 h；?抗室溫孵育2 h；加?ECL試劑進?顯?反應，測定蛋?條帶灰度值。以β-actin為內參，?的蛋?包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和pJNK，分別以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表?相應蛋?磷酸化?平。

結果與分析

01.RAW264.7細胞炎癥相關基因相對表達量的測定結果

采?實時熒光定量PCR測定HFPs對LPS誘導的巨噬細胞中重要促炎細胞因?IL-1β、IL-6和接觸式超聲在胞內蛋?及核酸提取過程中的應?TNF-α基因相對表達量，以及炎癥相關酶COX-2基因相對表達量的影響。如圖1所?，LPS刺激不同時間后，所有炎癥介質的mRNA表達?平均顯著提?（P＜0.05）。HFPs對促炎細胞因?的抑制作?與其劑量、LPS誘導時間及細胞因?種類相關。與LPS組相?，靜息狀態(tài)細胞經HFPs處理再經LPS誘導12、24 h后，IL-1β和IL-6的基因相對表達量顯著下降；HFPs顯著抑制LPS誘導3 h后TNF-α基因的相對表達，?在LPS誘導6?24 h的抑制作?總體不明顯。在LPS誘導24 h，較低劑量HFPs（30、60 μg/mL）預處理對COX-2基因表達具有顯著抑制作?，但提?劑量后該抑制效果消失，甚?出現(xiàn)反向促進作?，120 μg/mL HFPs預處理促使COX-2相對表達量較LPS組顯著上升（P＜0.05）。

02.MAPKs、NF-κB信號通路關鍵蛋?相對表達量測定結果

采?蛋?免疫印跡法測定巨噬細胞中MAPKs和NF-κB信號通路關鍵蛋?的磷酸化?平。如圖2所?，與陰性對照組相?，LPS刺激3 h后細胞中p38、JNK和p65蛋?的磷酸化?平顯著升?（P＜0.05）。90、120 μg/mL HFPs預處理對LPS誘導的巨噬細胞中p38和p65的磷酸化產?顯著抑制作?（P＜0.05），且呈?定的劑量依賴性，但對JNK的磷酸化沒有顯著影響，表明HFPs的抗炎作?可能與其靶向作?于p38 MAPK和NF-κB p65有關。

總結

客戶采?LPS誘導RAW264.7巨噬細胞建?體外炎癥模型，使?超聲波細胞粉碎機將蛋?及核酸從炎癥細胞中分離出來，從基因、蛋?相對表達?平??評估?棲菜多酚（Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs）的抗炎活性，為其在新型抑炎制劑的開發(fā)利?提供理論依據(jù)。超聲波細胞粉碎機在整個實驗中起到作?如下：

1. 輔助提取?棲菜中多酚組分，加速多酚組分釋放，縮短了提取進程，后續(xù)通過凍?步驟即可獲得?棲菜多酚粉末，溶解后備?；

2. 搭配TRIzol試劑對細胞中總RNA進?提取，試劑中含有苯酚，可加速細胞破碎和核酸釋放，還加?核酸酶抑制物質防?RNA降解，PCR結果表明提取的RNA濃度與純度較好，可?于相關基因表達情況的分析；

3. 搭配RIPA裂解液對細胞中的蛋?質進?提取，?幅減少原本冰上裂解所需時間（30 min），試劑中含有的蛋?酶抑制劑可防?蛋?降解，還含有磷酸酶抑制劑，防?蛋?提取后的再修飾，更好測定蛋?磷酸化狀態(tài)。