微生物生長曲線分析儀菌密度的小知識(shí)：大小和形狀的影響

上過微生物相關(guān)課程的同學(xué)，大抵都對菌液的OD600測量還有點(diǎn)印象：需要將樣本稀釋到合適的濃度，然后取樣置于比色皿內(nèi)，在分光光度計(jì)中測量600nm波長下的OD值。此外，也會(huì)有一個(gè)模糊的印象，當(dāng)OD為1時(shí)1mL菌液中大概對應(yīng)了多少數(shù)量的細(xì)胞。

網(wǎng)絡(luò)搜索1 OD與菌液濃度的對應(yīng)關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)給到的數(shù)據(jù)區(qū)間非常大，從1×10^7 ~2×10^9 cells/mL不等，但基本都會(huì)提到需要結(jié)合具體的菌種進(jìn)行分析，培養(yǎng)物中細(xì)菌細(xì)胞的大小和形狀會(huì)對OD600數(shù)值產(chǎn)生影響。

細(xì)胞大小對OD600的影響

Keiran Stevenson等研究人員制備了不同直徑的微珠的分散溶液（圖1），每種溶液的濃度和吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2A所示，在相同的OD600數(shù)值情況下，隨著微珠的直徑減小，對應(yīng)的微珠濃度顯著增加（圖2B）。

▲圖1 微珠的明場圖像。A：15.7±1.4 μm；B：10.0±0.6 μm；C：3.00±0.07 μm；D：0.96±0.07 μm；E：0.51±0.01 μm。E中給出的刻度尺適用于A-E。

▲圖2  球形微珠懸浮液的OD600測量。（A）對于給定的珠子直徑，微珠懸浮液的濃度與OD600之間的關(guān)系。（B）微珠濃度與微珠直徑之間的關(guān)系，同一條曲線上的點(diǎn)擁有相同的OD600值，隨著箭頭的方向，曲線從黑到紅分別對應(yīng)以下OD600值：0.05、0.1、0.5、1和10。每組5個(gè)重復(fù)，由于差異較小，部分?jǐn)?shù)據(jù)重疊。

細(xì)胞形狀對OD600的影響

Keiran Stevenson等研究人員還研究了真實(shí)的微生物形狀和大小對OD600的影響。不同遺傳背景的酵母、不同生長環(huán)境的大腸桿菌的顯微鏡圖片如圖3所示：酵母二倍體的體積大于酵母單倍體（圖3B-D）；大腸桿菌在亞致死濃度氨芐西林（ampicillin）的作用下被誘導(dǎo)成絲狀（圖3E）；對數(shù)生長期的大腸桿菌繁殖活躍，個(gè)體較大（圖3F）；穩(wěn)定期后期部分細(xì)胞死亡，個(gè)體較?。▓D3H）；穩(wěn)定期前期的大腸桿菌體積處于兩者之間（圖3G）。

▲圖3  在顯微鏡下獲得的不同微生物的代表性圖像。（B）酵母CLN3Δ純合二倍體突變體；（C）酵母二倍體；（D）酵母單倍體；（E）在亞致死濃度氨芐西林（ampicillin）存在下生長的大腸桿菌細(xì)胞，呈絲狀；（F）對數(shù)生長期的大腸桿菌細(xì)胞；（G）穩(wěn)定期早期的大腸桿菌細(xì)胞；（H）穩(wěn)定期晚期的大腸桿菌細(xì)胞。B中給出的刻度尺適用于B-H。

這些微生物培養(yǎng)液的濃度和吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，與正常的大腸桿菌樣品相比，經(jīng)抗生素氨芐西林誘導(dǎo)的絲狀大腸桿菌細(xì)胞的校準(zhǔn)曲線變化較大。酵母（細(xì)胞尺寸4~6μm）的細(xì)胞大小變化對校準(zhǔn)曲線的影響要比細(xì)菌（細(xì)胞尺寸0.7~1.5μm）的影響要小。

 ▲圖4  微生物濃度與OD600之間的關(guān)系。酵母CLN3Δ純合二倍體突變體（深灰）、酵母二倍體(淺灰)、酵母單倍體(紫色)、絲狀大腸桿菌(綠色)、以及對數(shù)生長期（黑色）、穩(wěn)定期早期(藍(lán)色)和晚期(紅色)的大腸桿菌。

綜上所示，微生物的形狀和大小都會(huì)對OD600測量產(chǎn)生影響，因此當(dāng)需要通過OD600來估算菌液濃度時(shí)，不同的微生物需要單獨(dú)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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參考文獻(xiàn)

Stevenson K ,  Mcvey A F ,  Clark I , et al. General calibration of microbial growth in microplate readers[J]. Scientific Reports, 2016, 6:38828.