非接觸式超聲在甲基化測序方面的應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

　　為了獲取能與巖沙?？舅?Palytoxin，PLTX)特異性結(jié)合的天然適配體，目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)提取得到的基因組通過超聲打斷的方式變成 100-300 bp 的 DNA 片段，再通過冷淬的方式獲得折疊后的 ssDNA。將 ssDNA 進(jìn)行甲基化修飾后進(jìn)行測序，同時(shí)對甲基化修飾后的片段進(jìn)行親和力測定，最終獲得特異性強(qiáng)、親和力高的天然適配體。

實(shí)驗(yàn)步驟

　　HaCaT 和 CHO-K1 細(xì)胞基因組 DNA 的提?。?/p>

　?、俪Ｒ?guī)培養(yǎng)細(xì)胞，待其融合度達(dá)到 70% - 80%左右時(shí)，吸除原培養(yǎng)基，向每 10 cm2的貼壁細(xì)胞中加入 1 mL PBS，用移液槍吹落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP 管中，5000 rpm 離心 5 min，棄上清，加入 200 μL 的 PBS 重懸細(xì)胞;

　?、诎凑?TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit 說明，加入 180 μL Buffer GB、20 μL Proteinase K 和 10 μL RNase A，充分吹打混勻，于 56℃水浴 10 min;

　?、巯蛄呀庖褐屑尤?200 μL 100%乙醇，充分吹打混勻后，將其轉(zhuǎn)移至已經(jīng)安置于 Collection Tube 上的 Spin Column 內(nèi)，12000 rpm 離心 2 min，棄濾液;

　　④將 500 μL Buffer WA 加入至 Spin Column 中，12000 rpm 離心 1 min;

　?、輰?700 μL Buffer WB 加入至 Spin Column 中，12000 rpm 離心 1 min，并重復(fù) 1 次;

　?、迣?Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12000 rpm 離心 2 min;

　　⑦將 Spin Column 安置于新的 1.5 mL EP 管上，在 Spin Column 膜的中央處加入 50-200 μL 已加熱至 65℃的 Elution Buffer，室溫靜置 5 min;

　?、?2000 rpm 離心 2 min，洗脫 DNA;

　?、崾褂?NanoDropTM One 進(jìn)行基因組 DNA 定量。

　　片段化基因組 :將提取的基因組 DNA 放置于SCIENTZ08-IIIC非接觸式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，設(shè)置功率80%，超聲開時(shí)間為 1 s，超聲關(guān)時(shí)間為 3 s，工作總時(shí)間為 150 min，溫度為 15℃，片段化基因組 DNA。

　　核酸凝膠電泳 :利用核酸凝膠電泳檢測 DNA 片段的大小，核酸凝膠的配方為：ddH2O 6.69 mL、40%聚丙烯酰胺 1.31 mL、5×TBE 2.4 mL、10%過硫酸銨(Ammonium persulfate，AP)72μL、四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine，TEMED)18 μL。在樣品中加入 5×上樣緩沖液，充分混合均勻，將配置好的凝膠放于電泳槽中，加入 1×TBE 電泳緩沖液，垂直拔出梳子，立刻用緩沖液沖洗加樣孔，將樣品緩慢均勻加入孔中，300 V 電泳 20 min，取出凝膠放置于水平搖床，用 Gel-red 染色液避光孵育 20 min，在凝膠成像儀中成像，檢測 DNA 片段大小范圍。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　基因組來源的 ssDNA 文庫的評價(jià)

　　超聲破碎基因組后，利用核酸凝膠電泳檢測基因組片段大小。如圖所示，DNA 片段長度富集于 200 - 300 bp 之間，當(dāng)其猝冷變性折疊成單鏈后，ssDNA 長度則集中于 200-300 nt 之間，從 HaCaT 和 CHO-K1 細(xì)胞來源的基因組文庫中各取 18 nmol 的 ssDNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)論

　　結(jié)論：提取得到的細(xì)胞基因組經(jīng)過超聲打斷后得到 200-300 bp 大小的片段，可直接用于高通量測序，也可重硫酸鹽轉(zhuǎn)化后用于甲基化測序。